以下是 Western Blot（WB）实验的详细操作步骤，结合常见注意事项和优化建议，帮助提高实验成功率：

一、实验前准备

1. 试剂与材料

   • 裂解液（RIPA缓冲液，含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）

   • 蛋白定量试剂（BCA或Bradford法）

   • SDS-PAGE凝胶（预制胶或自配：浓缩胶5%，分离胶8%-15%）

   • 电泳缓冲液（Tris-Glycine含0.1% SDS）

   • 转膜缓冲液（Tris-Glycine含20%甲醇）

   • 封闭液（5%脱脂奶粉或3% BSA）

   • 一抗、二抗（HRP标记）

   • ECL化学发光试剂

2. 仪器设备

   • 垂直电泳槽、转膜仪、恒温摇床、成像系统

二、实验步骤

1. 样本制备

• 细胞样本：

  1. 用预冷PBS洗涤细胞2次，吸干液体。

  2. 加入裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30分钟。

  3. 12,000 rpm离心10分钟（4℃），取上清。

• 组织样本：

  1. 液氮研磨组织成粉末，加入裂解液裂解。

  2. 超声破碎（冰浴，5秒×3次），离心取上清。

• 蛋白定量：BCA法测定蛋白浓度，调整至相同浓度（稀释至2-5 μg/μL）。

• 变性处理：加入5×Loading Buffer，95℃煮沸5-10分钟，-80℃保存备用。

• 常见问题及原因：

  1. 蛋白降解

     • 原因：样本反复冻融、未添加蛋白酶抑制剂或未低温操作。

     • 解决：使用新鲜样本，添加蛋白酶抑制剂，分装保存，冰上操作。

  2. 蛋白浓度过低

     • 原因：裂解不充分或目标蛋白表达量低。

     • 解决：增加上样量（如30-50 μg/孔），优化裂解液配方，或通过超滤浓缩样本。

  3. 杂质污染（如核酸或脂类）

     • 原因：样本未充分离心或未使用核酸酶。

     • 解决：离心后取中层澄清液，添加核酸酶减少粘度。

2. SDS-PAGE电泳

1. 制胶（以自配胶为例）：

   • 分离胶：按比例混合丙烯酰胺、Tris-HCl（pH 8.8）、SDS、APS、TEMED，灌胶后覆盖异丙醇。

   • 浓缩胶：分离胶凝固后倒掉异丙醇，灌入浓缩胶（pH 6.8），插入梳子。

2. 上样：

   • 每孔上样20-50 μg蛋白（含预染Marker），避免气泡。

3. 电泳：

   • 浓缩胶阶段：80-100 V恒压（约20分钟，至溴酚蓝进入分离胶）。

   • 分离胶阶段：120-150 V恒压（约1-1.5小时，至溴酚蓝接近胶底）。

常见问题及原因：

1. 胶体未凝固或漏胶

   • 原因：APS或TEMED失效、玻璃板未对齐。

   • 解决：检查试剂有效期，确保玻璃板密封，重新配制胶体。

2. 泳道歪斜或气泡

   • 原因：梳子插入不当或胶体混合不均匀。

   • 解决：斜插梳子避免气泡，灌胶后轻敲去除气泡。

3. 上样量超载导致拖尾

   • 原因：样本体积过大或蛋白浓度过高。

   • 解决：减少上样量，稀释样本或使用更厚胶（如1.5 mm）。

4. 条带扭曲或拖尾

   • 原因：电泳液不足、电压过高或样本未充分溶解。

   • 解决：补充电泳液，降低电压（夏季建议80-100 V），充分离心溶解样本。

5. 溴酚蓝呈“笑脸状”

   • 原因：胶体凝固不均或电泳温度过高。

   • 解决：冰浴降温，确保胶体完全凝固后电泳。

6. 条带弥散

   • 原因：电泳时间过长（小分子量蛋白）或胶浓度不匹配。

   • 解决：小分子量蛋白使用高浓度胶（如18%），缩短电泳时间。

3. 转膜（湿转法）

1. 预处理：

   • 将凝胶、PVDF/NC膜、滤纸浸泡于转膜缓冲液5分钟。

   • PVDF膜需甲醇活化30秒。

2. 转膜三明治组装（从负极到正极）：

   • 海绵垫→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵垫（驱赶气泡）。

3. 转膜条件：

   • 恒流200-300 mA，转膜时间根据蛋白分子量调整：

     • 小分子（<30 kDa）：30-60分钟

     • 中分子（30-100 kDa）：1-2小时

     • 大分子（>100 kDa）：2-3小时

4. 转膜后检查：用丽春红染色观察转膜效果（可选）。

常见问题及原因：

1. 转膜不完全（无目标条带）

   • 原因：转膜时间不足、缓冲液pH不适或膜未充分浸润。

   • 解决：高分子量蛋白延长转膜时间，使用CAPS缓冲液（pH 10.5），甲醇浓度调整为10%-20%。

2. 膜上出现气泡或蛋白泄漏

   • 原因：胶与膜未紧密贴合或转膜夹层有气泡。

   • 解决：用玻璃棒滚压去除气泡，确保膜完全湿润。

3. 低分子量蛋白过度转移

   • 原因：转膜时间过长。

   • 解决：缩短转膜时间，叠加两张膜捕捉漏转蛋白。

4. 封闭

• 用5%脱脂奶粉（或3% BSA）的TBST溶液封闭膜，室温摇床1小时（或4℃过夜）。

• 注意：磷酸化蛋白检测时禁用脱脂奶粉（改用BSA）。

常见问题及原因：

1. 高背景或斑点

   • 原因：封闭不充分、二抗聚集或封闭液未过滤。

   • 解决：使用5%脱脂奶粉或3% BSA封闭1-2小时，过滤封闭液和二抗

5. 一抗孵育

1. 稀释一抗：按说明书比例（通常1:500-1:5000）用封闭液稀释。

2. 孵育条件：

   • 4℃摇床过夜（推荐）或室温2小时。

3. 洗涤：TBST洗膜3次，每次5-10分钟。

6. 二抗孵育

1. 稀释二抗：用封闭液稀释HRP标记二抗（通常1:5000-1:10000）。

2. 孵育条件：室温摇床1小时。

3. 洗涤：TBST洗膜3次，每次10分钟。

抗体孵育常见问题及原因：

1. 非特异性条带

   • 原因：一抗浓度过高或交叉反应。

   • 解决：降低一抗浓度（如1:1000→1:2000），选择单克隆抗体或增加洗膜次数。

2. 信号弱或无信号

   • 原因：抗体失效、转膜失败或ECL试剂失活。

   • 解决：更换新鲜抗体，验证转膜效率（丽春红染色），使用超敏ECL底物

7. 显影

1. ECL显色：按1:1混合ECL A液与B液，均匀覆盖膜，避光反应1分钟。

2. 成像：

   • 将膜置于成像系统，调整曝光时间（1秒至数分钟），捕获信号。

   • 重复曝光避免过曝（白色条带提示信号过强）。

常见问题及原因：

1. 过曝（白色条带）

   • 原因：抗体浓度过高或曝光时间过长。

   • 解决：降低抗体浓度，缩短曝光时间，改用低灵敏度底物。

2. 条带位置异常

   • 原因：蛋白降解（如二聚体）或抗体识别修饰形式。

   • 解决：添加还原剂（如DTT），查询蛋白修饰信息。

三、结果分析

1. 内参校正：比较目标蛋白与内参（如β-actin、GAPDH）的灰度值。

2. 条带分析：

   • 使用ImageJ软件定量条带灰度值。

   • 计算目标蛋白与内参的比值，比较不同样本间差异。

3. 问题排查：

   • 无信号：检查抗体效价、转膜效率、显色系统活性。

   • 非特异条带：优化抗体浓度或更换特异性更高的抗体。

四、关键注意事项

1. 避免蛋白降解：全程低温操作，裂解液需预冷并加入蛋白酶抑制剂。

2. 防止膜污染：全程戴手套，使用镊子操作膜边缘。

3. 优化转膜条件：大分子蛋白需延长转膜时间，降低甲醇浓度（<10%）。

4. 抗体保存：一抗回收后可4℃短期保存（1-2周），长期需-20℃分装。

通过严格遵循上述步骤并针对性优化条件，可显著提高WB实验的重复性和准确性。建议初次实验时设置多种对照（阳性/阴性/空白），以快速定位问题。