众所周知，IHC、WB、ELISA是免疫学的三大工具，分别用于蛋白的定位，定性和定量实验。本期小O为您介绍 IHC 的定义及原理、实验操作流程、及其常见问题分析。也就是免疫组化实验(Immunohistochemistry)。

1、脱蜡水化：

因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。
脱蜡前，先将石蜡切片放置于烤片机或60°烘箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。烤完片子后，将其放入二甲苯（Ⅰ）中浸泡10min，更换二甲苯（Ⅱ）再浸泡10min，进行脱蜡。

注意事项：

• 脱蜡不全，组织出现非特异性背景着色现象。原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
• 为了脱蜡脱干净，可把切片放置在切片架上竖放进行烤片。
• 因为石蜡是不溶于水的，如果石蜡脱不完全，水流上去会模糊还有滞流感。

2、水化
在无水乙醇（Ⅰ）浸泡10min，更换无水乙醇（Ⅱ）再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，最后用蒸馏水浸泡5min。PBS洗3次，3min/次。

注意事项：

• 保持玻片在自来水中，直到准备进行抗原修复。
• 任何时候都不应该使玻片干燥，干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。

3、抗原修复

抗原修复是免疫组化中不可忽略的关键步骤。原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，是抗原与抗体结合点减少，从而令抗原抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。这种交联在高温加热或是蛋白酶水解作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。

修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。（可根据条件选择合适的修复方法进行修复），如下：

• 高压修复：把抗原修复液倒进高压锅中先加热煮沸，然后放入切片进行高压，高压结束，把高压锅放置在水流下降温放气。打开盖子自然冷却至少半小时。注意整个修复过程要保证修复液足够，修复过程切片始终浸没在修复液中。
• 微波修复：将切片置入盛有抗原修复液的容器中，将容器置入微波炉内高档加热至修复液沸腾，将微波炉调至低档维持加热10分钟，将容器连同修复液和切片移出降至室温。
• 煮沸修复：先把抗原修复液倒入锅中，先进行煮沸，然后放入切片，关盖不关严，注意修复时间，防止爆沸造成脱片，修复完成打开盖子，室温冷却至少半小时。

抗原修复缓冲液也分为多种，常用的则为柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），EDTA缓冲液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA缓冲液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）。同组织，不同PH值抗原修复液其染色结果强度不一样。有些抗原随抗原修复液PH值的变化，其染色强度没有明显变化；有些抗原随抗原修复液PH值的升高，其染色强度降低后又升高，有些抗原随抗原修复液PH值升高，其染色强度升高。没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。大部分抗原在修复液pH 8.0-9.0的范围值可以获得一个普遍较好的修复效果，所以碱性缓冲液应用普遍些。

4、消除内源性过氧化物酶的活性

用3%H₂O₂滴加到切片上，封闭5-10min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2-5min，冲洗三次。

 注意事项：

• 在一些过氧化物丰富的组织里面（肝脏、胎盘、血管瘤、急性炎症组织等）3%H₂O₂也不能完全消除内源性的过氧化物，改进的方法就是先用3%H2O2阻断10min，再用0.5%的高碘酸溶液阻断10min。

5、非特定位点封闭

为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。

 注意事项：

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  根据二抗系统中是否含有生物素而选择封闭剂，无生物素的二抗系统可以不使用封闭剂。封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性；封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。

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  封闭试剂原则上是选择二抗动物的非免疫血清封闭一些非特异性结合位点，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。

6、一抗孵育

免疫组化耗时长，步骤繁多，为了得到特异性染色，获得可靠结论，选择合适的一抗十分关键。基本原则是选择选择特异性强，灵敏度高，背景低的抗体，结果稳定、重复再现性良好的抗体。抗体的特异性体现在组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色。

注意事项：

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  一抗的冲洗原则：单独冲洗，防交叉反应污染；温柔冲洗，防止切片脱落；推荐浸洗方式。

7、二抗孵育

使用不同显色系统，可以呈现不一样的显色效果。

8、切片显色

加入配置的DAB显色液进行染色。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。

注意事项：

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  DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。

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  若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。

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  DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗 4ºC 过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

9、复染

为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用苏木素苏木精，细胞核蛋白几秒就可以，细胞浆或者细胞膜蛋白需要然20-30S，自来水冲洗，再用PBS返蓝5min。

注意事项：

• 复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关。
• 如果染色过浅可重复染色，如果染色过深可使用盐酸进行分化。
• 若试验目的只是想说明组织中蛋白表达的有无、量的多少和颜色的深浅，那就不需要苏木素复染；若实验目的是想看组织切片蛋白定位在胞核还是胞浆，那就最好苏木素复染。

10、脱水

依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，最后用100%酒精浸泡10min，更换酒精浸泡10min，最后用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯，再浸泡10min。

注意事项：

•  梯度酒精的作用：脱水，以便片子长期保存；二甲苯是为了使片子更加透明。

11、封片

捞出，加入中性树胶封片。滴加一滴树胶在组织旁盖上玻片，注意小心不要有气泡，树胶适量，如果树胶滴多了可使用二甲苯小心擦拭多余的树胶。

注意事项：

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  有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。

三、结果分析

镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。结果分析主要有两种方法：

阳性着色细胞计数法：在40倍光镜下，选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞。

评分法：在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

结果的判断原则：

1、必须设染色对照：没有对照染色的免疫组化结果是不可信的，免疫组化染色结果判定必须建立在对照染色实验成立的基础上。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。

2、染色阳性定位准确：染色阳性结果应表达在预期对应的组织结构中抗原特定部位上，且定位清晰准确，明确抗体标记的确切位置是核、质、膜还是血管壁或间质成分或复合表达，且无背景染色（或背景和阳性显色可明显区分）。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。

3、观察位置选择合适：尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达。此类阳性着色多存在内源或人为因素干扰。

4、免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准：当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。

四、常见问题及原因分析

1、对照/标本无染色

原因分析： 

• 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
• 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

2、弱阳性

原因分析： 如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：

• 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
• 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

3、非特异性染色

原因分析：是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。