| ELISA类型 | 原理 | 优点 | 缺点 | 使用场景 |
| 直接法ELISA | 将抗原或抗体固定于固相载体上，加入酶标记的抗体或抗原进行检测，最后通过底物显色反应观察结果 | 操作简单，检测速度快；消除了二级抗体的交叉反应 | 灵敏度低；每种ELISA需要特定的抗体，耗时且昂贵 | 抗原筛选、检测可溶性抗原 |
| 间接法ELISA | 将抗原或抗体固定于固相载体上，加入待测的抗体或抗原，再加入与待测抗体或抗原结合的酶标记二抗（次级抗体)，最后通过底物显色反应观察结果 | 灵敏度高，特异性强成本相对较低灵活；可使用多种一级抗体 | 存在二级抗体之间的交叉反应风险 | 抗体筛选、抗原结合表位分析 |
| 夹心法ELISA | 将捕获抗体结合在固相载体上，加入待测抗原，使其与固相抗体结合，再加入与待测抗原结合的检测抗体，再加入酶标记二抗，最后通过底物显色反应观察结果 | 样本纯化需求最小；灵敏度更高，特异性更强 | 必须使用“匹配对”的一级和二级抗体耗时且成本较高 | 抗原筛选、检测量小的抗原，或者其物理化学性质不允许充分粘附到孔上，或者样品中包含多种蛋白质的情况 |
| 竞争法ELISA | 样本中的抗原及预包被的酶标抗原，竞争性地与固相抗体相结合。样本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原就越少，最终显色也越浅。需要注意的是，显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。 | 适用于不容易被两种抗体同时结合的小分子目标因子 | 特异性较低 | 通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等 |
三、ELISA的实验方案
ELISA 实验通常分为几个步骤：包被、封闭、孵育、检测和结果分析。所以，接下来我为大家带来夹心法ELISA实验必备流程及注意事项
夹心法
标本收集及试剂准备：
1、样品预处理
下面列出的样品收集和储存条件旨在作为一般性指导。样品稳定性尚未评估。
a) 细胞培养上清液：在1000×g下离心15分钟去除颗粒，立即进行测定或等分装样品，并将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。（细胞培养上清液样品建议2倍稀释。例如：100μL样品+100μL的1×稀释液）
b) 血清：使用血清分离管，使样品在室温下凝结30分钟，然后在1000×g下离心15分钟。立即取出血清并进行测定或等分装样品，将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。（血清样品建议2倍稀释。例如：50μL样品+50μL的1×稀释液）
c) 血浆：使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。收集后30分钟内，以1000×g离心15分钟。立即测定或等分装样品，并将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。（血浆样品建议2倍稀释。例如：50μL样品+50μL的1×稀释液）注：柠檬酸盐抗凝剂血浆未经验证可用于本试验，使用时应自行验证可行性。溶血的样品不适合用于该测定。
d) 组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响检测结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨或匀浆机研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5-10分钟，取上清检测。
e) 细胞裂解液：贴壁细胞用预冷PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用预冷PBS清洗3次，每1×106个细胞中加入150-200μL的PBS重悬（推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适当减少PBS体积）并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。
f) 其它样本类型：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
2、洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液/稀释液加入19mL的蒸馏水）
3、标准品配置
取8个1.5ml离心管，分别标注S1,S2,S3,S4,S5,S6，S7，blank，第一管S1中加入标准品/样品稀释液900ul，第二至第八管中分别加入标准品/样品稀释液200ul，在第一管中加入标准品溶液（100ug/ml）100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管，如此反复作对倍稀释至S7，第八管为空白对照。配置好的标准曲线浓度为:10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.157、0ug/ml（标准品的用量及标准曲线范围也可根据自己需要配置）。
4、生物素化抗体工作液配置
使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。
5、SABC工作液配置
使用前20分钟，用SABC稀释液将100×SABC稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之
6、如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。
检测程序：
1. 加样：空白孔加入100μl标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板混匀后置37℃，60分钟。
2. 洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次，每孔加入1×洗液300μl，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。
3. 空白孔加入100ul标准品/样品稀释液，其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100ul，混匀后置37℃，60分钟。
4. 洗板：同上。
5. 每孔加入SABC工作液100ul，混匀后置37℃，30分钟。
6. 洗板：同上。
7. 每孔加入TMB显色底物 100ul，混匀后置37 ℃暗处反应10-20分钟（具体显色时间根据显色结果而定）。
8. 每孔加入50ul终止液，混匀，5分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果判断和计算
1. 所有OD值建议减除空白孔值后再进行计算，如空白孔OD低于0.1，也可以直接计算。
2. 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品OD值计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。
四、ELISA的实验小tips
1、板类型选择：优选伽马辐照板，确保底部平整透明。荧光检测用黑色底，化学发光用白色底
2、封闭缓冲液：基于哺乳动物蛋白，检测交叉反应，必要时用非哺乳动物蛋白。加0.05% Tween 20 减少非特异性结合
3、抗体选择：使用亲和纯化抗体提升信噪比
4、避免干燥：保持板湿润
5、恒定孵育：在固定温度下进行
6、即时稀释：结合物现用现配，避免久置
7、避光操作：对光敏感底物需避光处理
8、底物时效：底物溶液不超过1小时，注意温度控制
9、底物与读数：根据底物类型设置合适波长（如ABTS405-410nm，TMB 450 nm 等)
10、清洁底部：去除指纹，确保准确读数
11、标准曲线：自制ELISA前，先优化标准曲线
12、背景信号控制：检查非特异性结合、封闭效果、样品反应性等
13、信号验证：通过阴性对照和空白孔检查背景信号
14、优化后测试：调整封闭和洗涤条件以维持最佳信噪比
15、洗板机维护：每日检查对齐和填充量
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